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PEG修飾產物的分離純化方法

沉淀法

蛋白質在一定濃度的鹽溶液或有機溶劑中會發生沉淀,而PEG由于其兩親性則繼續保持溶解狀態,通過簡單的離心就能將蛋白質與PEG分離開來。唐微等采用硫酸氨沉淀法可將rIL-2和PEG完全分離開。

膜過濾法

透析膜或超濾膜上具有一定孔徑大小的微孔,若在膜中加入不同分子量的混合物,則小于孔徑的分子會透過膜,而大分子則留在原處。由于分辨率低,一般僅用其除去修飾混合物中的游離PEG或濃縮分離產物超濾法適合于分離產物的濃縮和換液,與沉淀法相比活性損失小,無需脫鹽,但缺點是成本較高,易吸附蛋白。

凝膠過濾層析法

凝膠過濾層析的分離原理是分離顆粒介質中具有大量孔徑均一的網狀孔道。分離樣品中的小分子物質可以進入顆粒內部,所經歷的路程較長,因此流出時間較長,后出峰;大分子物質從顆粒外通過,因此先出峰,據此可以分離不同分子量的物質。PEG修飾蛋白質的分子量大于天然蛋白質,因此出峰較天然蛋白質早,PEG偶聯越多,修飾蛋白質出峰越早。McGoff等用GF柱分離PEG修飾SOD,可將未修飾、單點、兩點修飾SOD分開。

離子交換層析法

離子交換層析在分離純化蛋白質的層析手段中使用最廣泛,其分離原理是離子交換樹脂結合帶有大量電荷的側鏈,當溶液pH偏離等電點時,蛋白質就會帶電荷,若所帶電荷與離子交換樹脂側鏈電荷相反,蛋白質就可與之結合,結合的蛋白質可根據結合力的不同用不同濃度的鹽離子洗脫,從而達到分離純化效果。影響PEG修飾蛋白質帶電荷數的因素目前認為有兩個,一方面大多數PEG修飾的位點是蛋白質表面的游離氨基,由于氨基在酸性和中性環境下結合氫質子而帶正電荷,PEG修飾蛋白質后這些氨基失去與氫質子結合能力,蛋白質的正電荷數會減少,等電點偏酸。另一方面PEG自身不帶電荷,當PEG覆蓋于蛋白質表面時可能會阻礙蛋白質與離子交換樹脂側鏈的結合,從而導致修飾蛋白質的洗脫鹽濃度比天然蛋白質低。采用離子交換層析分離PEG修飾蛋白質的最大優勢在于PEG不帶電荷保證了它不會吸附于柱上,因而可以很方便的將PEG與蛋白質分開。劉麗軍等用CM Sepharose FF分離PEG修飾的rhIFNa-2b,洗脫峰依次為未結合的PEG、多點修飾產物、單點修飾產物和未修飾的rhIFNa-2b。根據結果分析PEG修飾蛋白質在離子交換層析中主要受PEG屏蔽作用影響,無論是用陰離子還是陽離子交換層析,蛋白上偶聯PEG個數越多,結合力越弱,出峰越早;其次受氨基修飾的影響,由于陰離子交換樹脂結合的主要是蛋白質的羧基,受氨基修飾影響較小,因而分離效果不如陽離子交換樹脂。離子交換層析時緩沖液pH值至少應與蛋白質等電點相差一個單位,修飾樣品應用緩沖液或水稀釋以降低樣品的離子強度。

疏水層析和反相色譜法

疏水層析和反相層析的原理是分離介質帶有疏水側鏈,蛋白質在高鹽濃度溶液或有機溶劑中變性,暴露出疏水部位,與分離介質結合,降低鹽濃度或有機溶劑濃度可將其洗脫下來。PEG具有兩親性,但與蛋白質相比疏水性更強,因此PEG修飾蛋白質的疏水性強于天然蛋白,與分離介質的結合力更強,較天然蛋白晚出峰。Katre等采用疏水層析的梯度洗脫法成功將rIL-2與PEG-rIL-2分開。反相層析由于使用有機溶劑作為流動相,導致蛋白質失活,一般用來分析而不是分離活性蛋白。


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